PRaCTICA... Extracción y separación de ADN

Extracción y separación de ADN

Introducción.

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas: En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Los jabones utilizados emulsionan los lípidos de las membranas celulares y las rompen. La sal evita la unión de las proteínas al ADN.  Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interface entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

Antecedentes.

Ademas del agua, los carbohidratos, las proteinas, y los lípidos, los seres vivos están constituidos por otras moléculas que, aunque en menor cantidad, desempeñan funciones muy importantes.

Los Ácidos nucleicos (DNA y RNA) son biomoléculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas. Son moléculas complejas producidas por células vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moléculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus características específicas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteinas.

Objetivo.

Extraer el ADN y ARN de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

Material.

Tubos de centrifuga 1ml.

Tubos de ensayo 5 ml.

Centrifuga.

Micropipetas de 1,000 y 200 ul.

Agua destilada estéril.

Etanol al 100% frio.

NaCl 3M.

Buffer de extracción.

Fenol/cloroformo/isopropanol frio.

Mortero y pistilo.

Papel aluminio.

Guantes.

Hígado de pollo.

Procedimiento.

A)._ rompimiento de membranas y paredes celulares.

Se tomo una muestra de hígado, posteriormente la muestra se homogenizó asta formar una textura de puré.

*El maceramiento del hígado es utilizado para el rompimiento de los tejidos y paredes celulares.

B)._ digestión.

En cuatro tubos para PCR se le coloco  1 gramo del hígado macerado. Para poder colocar la muestra asta el fondo  se tuvo que agitar con mucha fuerza el tubo. Por ultimo se agrego 500 ul del buffer de extracción en cada tubo.

* La solución buffer impide la unión del material genético con las proteínas.

C)._ separación de proteínas, carbohidratos y lípidos.

En el tercer paso se coloco a la muestra del tubo 500 ul de fenol,  con ayuda de guantes de latex y una micropipeta.

Por ultimo los cuatro tubos se colocaron en una centrifuga a 1000 rpm por un lapso de 5 min.

*la utilización de la centrifuga es para acelerar la separación de las biomoléculas.  Al fondo siempre se precipitan las moléculas de mayor densidad.

D)._ precipitación de los ácidos nucleicos.

Ya terminado los 5 minutos de centrifugación, a cada uno de los cuatro tubos se le extrae la fase más superior de la muestra y se coloca en un solo tubo para PCR.   

Ya extraída la fase acuosa se le coloco 400 ul de etanol y 75 ul de NaCl 3M. Pasado esto se agita vigorosamente en el Vortex.

Por ultimo se coloco el tubo en la ultracentrífuga a 1000 rpm en un lapso de tiempo de 2 min.  

Conclusiones.

El proceso para la separación del material genético es un método muy meticuloso, en el cual se requiere mucha asepsia y un buen  manejo de los materiales.  Por el cual requiere una serie de etapas básicas.

Cuestionario.

1._ ¿Porque el ADN en solución se precipita en presencia de un alcohol frió?

R= Por que el ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita. Ya que es insoluble en el alcohol.

2._ ¿Cómo podrías cuantificar la cantidad de DNA de tu muestra?

R= por espectrofotometría. Debidos a que  los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta.

3._ ¿Cuál es la función y la importancia del DNA en los organismos?

R= Estas moléculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus características específicas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteinas.

4._ Como se separamos de nuestra muestra el ADN del ARN?R= se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN y que impiden que se unan al ADN.

5._ ¿Cuál es la función del cloroformo?

R= es utilizado para extraer nonatos celulares, ósea todos los componentes celulares.

Conclusión

El proceso por el cual el material genético se conversa se conoce como; replicación, en este proceso enzimático  el ADN, se duplica y crea así dos cadenas semejantes a la cadena original.  También se entendió a detalle las diferencias de replicación en procariontes y eucariontes, ya que en bacterias todas las enzimas trabajan a mayor velocidad y solo existe un origen de replicación. Por otro lado en las células eucariotas   poseen más enzimas, pero trabajan más lento, pero como presentan más orígenes de replicación al final el proceso en eucariontes es más rápido que en bacterias.

4.3. Control de la replicación

El proceso resultante de la duplicación de ADN se conoce como división celular, la cual se ha estudiado a nivel citológico estableciéndose ciertas pautas cubiertas por lo que se conoce como ciclo celular.

El ciclo celular es un conjunto ordenado de sucesos que conducen al crecimiento de la célula y la división en dos células hijas. Las células que no están en división no se considera que estén en el ciclo celular. Las etapas, mostradas a la derecha, son G₁-S-G₂ y M.

Fase G₁: Es la primera fase del ciclo celular, en la que existe crecimiento celular con síntesis de proteínas y de ARN. Es el período que trascurre entre el fin de una mitosis y el inicio de la síntesis de ADN. Tiene una duración de entre 6 y 12 horas, y durante este tiempo la célula duplica su tamaño y masa debido a la continua síntesis de todos sus componentes, como resultado de la expresión de los genes que codifican las proteínas responsables de su fenotipo particular.

Fase S: Es la segunda fase del ciclo, en la que se produce la replicación o síntesis del ADN, como resultado cada cromosoma se duplica y queda formado por dos cromáticas idénticas. Con la duplicación del ADN, el núcleo contiene el doble de proteínas nucleares y de ADN que al principio. Tiene una duración de unos 6-8 horas.

Fase G₂: Es la tercera fase de crecimiento del ciclo celular en la que continúa la síntesis de proteínas y ARN. Al final de este período se observa al microscopio cambios en la estructura celular, que indican el principio de la división celular. Tiene una duración entre 3 y 4 horas. Termina cuando la cromatina empieza a condensarse al inicio de la mitosis.

Fase M: Es la división celular en la que una célula progenitora se divide en dos células hijas idénticas. Esta fase incluye la mitosis, a su vez dividida en: profase, metafase, anafase, telofase; y la citocinesis, que se inicia ya en la telofase mitótica.

Se cree que muchos tumores son el resultado de una multitud de pasos, de los que una alteración mutagénica no reparada del ADN podría ser el primer paso. Las alteraciones resultantes hacen que las células inicien un proceso de proliferación descontrolada e invadan tejidos normales. El desarrollo de un tumor maligno requiere de muchas transformaciones genéticas. La alteración genética progresa, reduciendo cada vez más la capacidad de respuesta de las células al mecanismo normal regulador del ciclo.

4.4 Replicación in vitro del ADN (PCR)

es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,^[] cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

Pasos de la PCR.

Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual.

Alineamiento o unión del cebador

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C.

Extensión o elongación de la cadena

Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3'.

4.4.1 Secuenciación del ADN

Una secuencia de ADN o secuencia genética es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda, con la capacidad de transportar información. Una sucesión de cualquier número de nucleótidos mayor a cuatro es pasible de llamarse una secuencia. En relación a su función biológica, que puede depender del contexto, una secuencia puede tener sentido o antisentido, y ser tanto codificante o no codificante. Las secuencias de ADN pueden contener "ADN no codificante."

En algunos casos especiales, las letras seguidas de A, T, C, y G se presentan en una secuencia. Esas letras representan ambiguedad. De todas las moléculas muestreadas, hay más de una clase de nucleótidos en esa posición. Las reglas de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:

A = adenina

C = citosina

G = guanina

T = timina

R = G A (purina)

Y = T C (pirimidina)

K = G T (keto)

M = A C (amino)

S = G C (enlaces fuertes)

W = A T (enlaces débiles)

B = G T C (todos y A)

D = G A T (todos y C)

H = A C T (todos y G)

V = G C A (todos y T)

N = A G C T (cualquiera)

La replicación del ADN...!

La replicación del ADN produce una copia de sí mismo por medio de enzimas que además de ser muy exactas poseen un sistema de reparación de errores. El mecanismo de replicación es  esencialmente el mismo en todas las células. Luego del descubrimiento de la estructura del ADN, en 1953, dos biólogos moleculares americanos, Matthew Stanley Meselson y Frank Stahl demostraron que este se replica de una manera semiconservativa, es decir que la nueva cadena se sintetiza utilizando una de las hebras preexistentes como molde. Las moléculas de ADN “hijas” están formadas por una cadena nueva y una original que sirve como molde.

Para que esto ocurra, la célula debe “abrir” la doble cadena de ADN en una secuencia específica denominada origen de replicación (en bacterias) o secuencia de replicación autónoma (en eucariotas) y copiar cada cadena.  En la replicación participan varias enzimas. Las ADN polimerasas sintetizan una nueva cadena de ADN. Para esto utilizan como molde una de las hebras y un segmento corto de ADN, al que se le agregan los nuevos nucleótidos. Este segmento funciona como cebador (primer, en inglés). La ADN polimerasa agrega nucleótidos al extremo 3’ de la cadena en crecimiento.

4.1 Replicación del genoma procariótico

La replicación en bacterias se ajusta al modelo semiconservativo. En las bacterias existe un solo origen de replicación, denominado Ori C y, a partir de este único punto de origen, la replicación progresa en dos direcciones, de manera que existen dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicación.  Cairns en 1963, llevó a cabo otro experimento en la bacteria E. coli que además de demostrar que la replicación de su ADN se ajustaba al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953), también demostraba que el ADN de E. coli es circular. Se trata se la primera evidencia citológica (mediante observación al microscopio) de la circularidad del cromosoma bacteriano, ya que mediante técnicas de construcción de mapas de conjugación, ya se había demostrado previamente por Jacob y Wollman que el ADN bacteriano tenía un mapa circular.

El experimento que realizó Cairns consistió en mantener un cultivo de E. coli creciendo durante dos generaciones sucesivas en un medio que contenía Timidina tritiada (TH³), es decir, utilizaron un nucleótido (la Timina) marcado con un isótopo radiactivo (tritio, H³). Por tanto, cuando las bacterias sintetizaban su ADN empleaban dicho nucleótido marcado. Además, Cairns desarrolló un sistema para extraer el ADN de E. coli sin romperlo (intacto) y extenderlo sobre un portaobjetos para posteriormente realizar una autorradiografía, revelarla  y observar los resultados al microscopio. Para realizar la autorradiografía, empleaba una emulsión fotográfica que colocaba en contacto directo con la preparación, de forma que en aquel lugar de la preparación en que existía TH³, las partículas b del tritio impresionaban la emulsión fotográfica y al revelarla aparecía una macha o punto en ese lugar. Las autorradiografías correspondientes a la primera generación de replicación presentaban imágenes de puntos formando un círculo. En las autorradiografías correspondientes a la segunda generación de replicación se observaban imágenes de puntos en forma de la letra griega q pero que mostraban una región del interior con doble cantidad de puntos. 

4.2. Replicación del DNA en eucariontes.

Es similar a la de los procariontes, es decir, semiconservativa y bidireccional. Existe una hebra conductora que sintetiza de manera continua y la retardada de forma discontinua con fragmentos de Okazaki.

¿Que son los fragmentos de Okazaki?

Se conoce como fragmentos de Okazaki a los fragmentos de ADN que son el resultado de la síntesis de ADN en la hebra discontinua. Éstos se sintetizan en dirección 5’→ 3’ pero discontinuamente; después de la eliminación de los cebadores (RNA), se unen mediante la ADN ligasa.

Sin embargo, la replicación en eucariotas presenta ciertas peculiaridades;

El ADN de los eucariontes está fuertemente asociado a los octámeros de histonas, en forma de nucleosomas, por lo que además de replicarse el ADN, deben duplicarse también las histonas. Al parecer, tanto los nuevos nucleosomas como los antiguos se reparten de manera aleatoria entre las dos nuevas hebras hijas: en la retardada y en la conductora.

La longitud del ADN de un cromosoma eucariótico es mucho mayor que el ADN bacteriano, de ahí que no haya un único origen de replicación. Para que el proceso sea más rápido, existen numerosas burbujas de replicación a lo largo de cada cromosoma.

Veamos ahora como se lleva acabo el proceso;

1._ Las cadenas de ADN están unidas por puentes de hidrógeno, que debemos romper para facilitar la separación de las cadenas para ser copiadas, esta separación la lleva a cabo las enzimas helicasas.

2._ Como el desenrollamiento de la doble hélice da lugar a superenrollamientos en el resto de la molécula, capaces de detener el proceso, se hace preciso la presencia de la enzima topoisomerasa I que eliminen las tensiones en la fibra.

3._ A continuación, para evitar que las dos hebras vuelvan a reunirse y formar los puentes de hidrógeno se colocan unas proteínas llamadas SSB (Single-Strand DNA Binding proteins), que estabilizan las cadenas sencillas.

4._ Como ninguna ADN-polimerasa puede actuar sin cebador, interviene primero una ARN polimerasa (primasa) que si lo puede hacer, sintetiza un corto fragmento de ARN de unos 10 nucleótidos denominado primer que actúa como cebador.

5._ Después interviene la ADN polimerasa III, que a partir de este cebador comienza a sintetizar en dirección 5’,3’ una hebra de ADN partir de nucleótidos trifosfato. La energía necesaria para el proceso es aportada por los propios nucleótidos que pierden dos de sus fósforos. Esta nueva hebra se sintetiza en el sentido que se abre la horquilla de replicación, es de crecimiento continuo y se denomina hebra conductora.

6._ Sobre la otra hebra (hebra discontinua o retardada) la ARN polimerasa sintetiza unos 40 nucleótidos de ARN en un punto que dista unos 1.000 nucleótidos de la señal de iniciación. A partir de ellos la ADN polimerasa III sintetiza unos 1.000 nucleótidos de ADN, formándose un fragmento de Okazaki. Este proceso se va repitiendo a medida que se van separando las dos hebras patrón.

7._ A continuación interviene la ADN polimerasa I, rellena los huecos con nucleótidos de ADN.

8._ Finalmente la ADN ligasa unirá los dos extremos, tanto en la cadena continua como los sucesivos fragmentos de Okazaki que se van formando en la cadena discontinua.

video Replicacion del ADN

http://www.youtube.com/watch?v=8xnmaj9m87s

Tarea Experimento de Meselson-Stahl

Meselson y Stahl (1958) demostraron que el DNA de E. coli se replica de forma semiconservativa, tal como habían propuesto Watson y Crick (1953) al elaborar el modelo molecular del DNA y tal como podía deducirse de los experimentos realizados previamente por Taylor (1957) sobre la síntesis de DNA en eucariotas. El experimento de Meselson y Stahl está basado en la variación de la densidad de flotación del DNA derivada de la utilización del isótopo pesado del nitrógeno (N15) y el análisis de dicha variación mediante la técnica de Ultracentrifugación en gradiente de Cloruro de Cesio.

desarrollo del experimento:

Se hicieron crecer cultivos de E. Coli, en un medio con nitrógeno radiactivo N15; después de lavar, se dejó que continuara el crecimiento en un medio normal con N14. El momento adecuado, se añadió el ADN aislado a una solución densa de CsCl.

El tubo se colocó en una centrifuga, haciéndola funcionar a velocidades suficientemente altas como para producir la sedimentación parcial del CsCl, formándose un gradiente de densidad mas denso en el fondo y menos denso arriba. En este gradiente, el ADN forma bandas en el nivel donde tiene la misma densidad que la solución salina. Después de una generación de crecimiento en el medio normal el ADN aislado forma una banda que se encuentra a mitad de camino entre el punto de igual densidad para el ADN totalmente marcado con N15 y la posición esperada para el ADN liviano normal (N14).

Después de una generación de crecimiento, entonces, cada molécula de ADN tenía una mitad vieja y una mitad nueva. Calentando el ADN para separar las cadenas y luego recentrifugandolas, se hizo evidente que las moléculas hibridas tenían una cadena de polinucleótidos parental (enteramente con N15) y otra recién sintetizada (completamente con N14). En otras palabras, el ADN se replica en forma semiconservativa.

bibliografia:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC528642/?page=3

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:DNAreplicationModes.png

Replicación del ADN

SEP                      SNEST                      DGEST

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

Nombre del Alumno:

Rubén Santibáñez Alejandrez

Número de Control:

09930057

Carrera:

Lic. biología

Ciudad Altamirano, Gro. México. 06 Marzo del 2012

Introducción

En este curso de biología molecular se describirá a detalle uno de los  fenómenos  más notables de todos los seres vivos que es; la capacidad de replicación de su material genético a través de  una  enzima denominada DNA-polimerasa que esta  cataliza la formación de cadenas de nucleótidos por la adición sucesiva de nucleótidos.  Este proceso de replicación no comienza a replicar ni al azar ni en cualquier parte. 

 Este controlado por un complejo sistema de regulación intracelular que le indica a la enzima el momento del ciclo celular en que debe comenzarse la replicación, la enzima reconoce una secuencia de nucleótidos llamada origen de replicación que marca el punto el que ha de comenzarse la replicación. Este proceso fue confirmado en el año de 1958 por Meselson y Stahl en el cual denominaron que  la replicación del   ADN era semiconservadora. Una replicación semiconservadora es aquella en que la cadena de dos filamentos en hélice del ADN se replica de forma tal que cada una de las dos cadenas de ADN formadas consiste en un filamento proveniente de la hélice original y un filamento nuevo sintetizado.

Para investigar la forma de replicación del ADN, Meselson y Stahl idearon una forma muy ingeniosa que se basa en dos premisas fundamentales, por una parte está el hecho de que el nitrógeno es uno de los principales elementos del ADN, y por la otra el nitrógeno posee dos isótopos que pueden ser distinguidos mediante técnicas de laboratorio. ¹⁴N es el isótopo más abundante del nitrógeno, el ADN es también viable con el isótopo ¹⁵N el cual es más pesado y no es radioactivo, solo es más pesado que el nitrógeno común. De esta forma Meselson y Stahl mediante un inteligente planteo del experimento, en el que utilizaron bacterias y observaron cómo replicaban su ADN, pudieron obtener información que les permitió identificar el mecanismo de replicación del ADN y descartar ciertas teorías alternativas.

Objetivos.

1._ Entender como se transmite la información genética entre los seres vivos y su relación con los mecanismos de herencia

2._ Distinguir los mecanismos de duplicación del material genético en procariotas y eucariotas.

Metodología.

Para la realización de la unidad 4º se tomaran referencias sobre la bibliografía de:

* M. Devlin Thomas. 2000. Bioquímica, libro de texto con aplicaciones clínicas. Editorial Reverte, S.A.  Impreso en México.

*Puche Acosta F. Javier.  Biología molecular. Antología de la materia Biología celular, 2012.