Transformación bacteriana.

En determinadas condiciones fragmentos de ADN exógeno con estructura helicoidal intacta pueden unirse a células bacterianas competentes y entrar en su interior. El ADN entra en el espacio periplasmático, entre la pared celular y la membrana plasmática, allí una endonucleasas corta las dobles hélices en fragmentos de menor tamaño, posteriormente se degrada una de las dos hélices, de manera que lo que entra en el citoplasma es ADN de una hélice (monocatenario).

Bacterias con capacidad de trasformación natural.

Gram positivas	Gram negativas
Streptococcus pneumoniae	Azotobacter agilus
Bacillus subtilis	Haemophilus influenzae
Bacillus cereus	Pseudomonas stutzeri
Bacillus licheniformis	Pseudomonas alcaligenes
Bacillus stearothermophilus	Moraxella osloensis
	Moraxella urethralis

Streptococcus  pneumoniae

Este tipo de bacterias Gram-positivas, se hacen competentes rápidamente durante la fase exponencial de crecimiento, esta conversión de células no competentes a células competentes esta determinado por una proteína pequeña llamada factor de competencia, que es producida de forma constante y liberada o excretada al medio externo por las células de Streptococcus  pneumoniae.  Pero solo se desarrolla la competencia cuando la densidad de la población bacteriana es muy alta, ya que se necesita un elevado  valor crítico del factor de competencia. Para ello se sintetizan un conjunto de doce proteínas, que realizan el proceso de trasformación. Con estas proteínas las células competentes pueden absorber DNA de doble cadena en diferentes sitios de su superficie externa, para posteriormente cortarlo en fragmentos más cortos, gracias a la acción de enzimas.  Luego una de las cadenas es digerida por nucleasas y la otra penetra a la célula. Cabe mencionar que estos dos pasos anteriores se llevaron acabo en el espacio periplasmático.  Al entrar el DNA al citoplasma de la bacteria se une al DNA cromosómico de la bacteria.  

La integración del DNA homologo tiene lugar mediante un proceso de sustitución de la cadena formando como producto intermedio una región heterodúplex. Las dos cadenas que forman el heterodúplex pueden no ser idénticas, en cuyo caso habrá regiones en las que el heterodúplex no se mantendrá unido mediante puentes de hidrogeno. La existencia de tales de tales regiones puede desencadenar la operación de reparación del DNA de la célula receptora, cuya activación hace que a veces se eliminen regiones mal emparejadas del exogenote y que sean reemplazadas por bases complementarias del endogenote. Este proceso es denominado corrección.

Haemophilus  influenzae

El proceso de transformación de esta bacteria Gram negativa difiere en muchos aspectos fundamentales del sistema Streptococcus. En este proceso no se produce ningún factor de competencia. Mas bien este tipo de células se hacen competentes em medios ricos.

En este proceso solo puede penetrar DNA homologo ósea DNA de bacterias de la misma especie o de bacterias estrechamente relacionadas. El DNA se fija y penetra a las células de manera muy significativa. Otra diferencia ademas es que el material genético que penetró a la célula es DNA de forma bicatenaria, permaneciendo así asta el momento de su integración.    En el endogenote.     

     

Roger Y. Stanier, et al, Microbiología.  2^a edición. Editorial REVERTÉ, S.A. impreso en España. 1992.  

Conclusiones de la unidad # 9.

Todas las bacterias, son organismos capaces de adquirir material genético, para ser capaces de adaptarse al medio, pues ya que todas las bacterias se reproducen de manera asexual (bipartición). Por este proceso se generan dos células idénticas a partir de  una célula  madre, en cambio si no existieran las diferentes modalidades de tomar  DNA, ya sea de otros organismos, del medio externo, o a través de fagos. Todas las bacterias ya hubiesen desaparecido, pues como se reproducen de forma asexual, no existe una recombinación, como es el caso de la reproducción sexual em el momento de la fecundación.  Por otro lado estos organismos  eficientes tuvieron que buscar formas de adaptarse mucho más al medio, para ello desarrollaron varias formas;

La transducción, que es un proceso por el cual las bacterias transfieren DNA a otro bacteria receptora, utilizando fagos.  La conjugación, es el proceso por el cual bacterias intercambian plásmidos F, a través de estructuras llamadas pilis. Y por ultimo la transformación es el mecanismo por el cual una bacteria puede tomar DNA del medio. Estos son los procesos por el cual las bacterias pueden recombinan sus genes y se vuelven más adaptables al medio.      

¿Cómo se realiza el control genético del gen BRCA_?

El gen BRCA, es un gen asociado con el cáncer de mama y ovarios.

BRCA1: es un gen descubierto por la Dra. Mary Clarie King en el año 1990, que posee 22 exones distribuidos en 100Kb DNA. Se localiza em el cromosoma 13.

BRCA2: fue ubicado en el cromosoma 13, por el año de 1994.

Control genético…

La biología del cáncer de mama no se conoce hoy em día completamente, pero aproximadamente, el 10% de las  neoplasias (proliferación anormal de células), ocurren en mujeres que presentan una pérdida heredada de la función del gen de supresión tumoral BRCA1. Este probablemente tiene la función de suprimir la proliferación de células epiteliales de la mama con alteraciones en el DNA.  Este mecanismo se desconoce, pero es muy probable que sea similar al gen p53.

Para el restante 90% de las neoplasias de mama, que ocurre  con BRCA1  negativos, existe otro tipo de eventos moleculares de utilidad. Las mutaciones adquiridas en el oncogén HER-2/neu, producen una elevada expresión de la proteina HER-2/ neu en el tumor.  El HER/neu es un gen humano descubierto por su parecido con el gen retrovírico v-erb-B. Este gen codifica mRNA HER-2/neu (4,6 Kb), que sintetiza la proteina  HER-2/neu (p 185).  Esta proteina es un receptor de la membrana celular, con actividad tirosincinasa intracelular y un lugar dominante de unión extracelular.

Aunque BRCA1 y BRCA2 no muestran una secuencia homologa, actúan em vías similares e interaccionan con los mismos complejos multiproteicos. Una función clave de ambos parece ser su papel en la protección del genoma frente al daño a detener al detener el ciclo celular  y estimular la reparación del daño al genoma en un proceso complejo no totalmente comprendido.  El BRCA1 se fosforila en respuesta al daño y puede transducir señales de daño del DNA desde cinasas del punto de control asta proteinas efectoras. De la misma forma el BRCA2 se puede unirse directamente al DNA actuando en la recombinación homologa para la reparación libre de errores de las roturas en la doble cadena del DNA. No esta muy claro por qué la pérdida de estas funciones altera específicamente a la mama. Quizá la proliferación intermitente del epitelio mamario hace que este órgano sea más susceptible al acúmulo de daño genético o, posiblemente otros tipo celulares tienen mecanismos adicionales de reparación del DNA de los que carece la mama.                  

  Gen P53: Se trata de un gen supresor que se encuentra en el brazo corto del cromosoma 17 banda 13, y codifica una proteína nuclear de 53 Kd. La función del P53 en estado normal es la de regulación del ciclo celular ante un daño del DNA, por lo que se le ha denominado "guardián del genoma". Cuando el DNA se daña, el P53 se acumula en el núcleo, y es capaz de detener el ciclo celular en G1 antes que se duplique el DNA e iniciar su reparación. P53 va a inducir la síntesis de proteínas inhibidoras de los complejos ciclina-CDKs, bloqueando el ciclo celular. Si se repara la lesión el ciclo continúa, pero si no se repara se induce la apoptosis de la célula mediante la expresión de genes como bax. La alteración de la proteína P53 produce inestabilidad genómica, siendo las células incapaces de evitar la proliferación o activar la apoptosis, cuando está comprometida la integridad del ADN, de manera que son capaces de acumular las mutaciones para completar la carcinogénesis.

http://books.google.com.mx/books?id=01yvtLPQD7QC&pg=PA392&dq=control+genetico+del+gen+BRCA&hl=es&sa=X&ei=LUvNT6rYJOHu2QWO7oTRAg&ved=0CD4Q6AEwAQ#v=onepage&q=control%20genetico%20del%20gen%20BRCA&f=false

http://books.google.com.mx/books?id=zg9DdX1X1IoC&pg=PA35&dq=control+genetico+del+gen+BRCA&hl=es&sa=X&ei=fVLNT4vREuqQ2AWV4OSPAg&ved=0CDgQ6AEwAA#v=onepage&q=control%20genetico%20del%20gen%20BRCA&f=false

http://books.google.com.mx/books?id=g3JtFNycJ_sC&pg=PA190&dq=control+genetico+del+gen+BRCA&hl=es&sa=X&ei=mVLNT67KBIrg2AXw1tiQAw&ved=0CGoQ6AEwCQ#v=onepage&q=control%20genetico%20del%20gen%20BRCA&f=false

Mecanismos de transferencia artificial

9.2 Mecanismos de transferencia artificial.

9.2.1 Físicos.

biobalistica.

El término biobalística deriva de la conjunción de “biología y balística” o “balística biológica”. Este es un método muy original ideado y refinado en la década de 1980 por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (EE.UU.), que permite introducir ADN a virtualmente cualquier tipo de célula. En este procedimiento el ADN es introducido en las células por medio de partículas microscópicas (micropartículas) aceleradas a velocidades supersónicas, que atraviesan la pared y la membrana celular. Las partículas son aproximadamente esféricas (de 0.4 a 2.0 micrómetros de diámetro), están hechas de materiales densos como oro o tungsteno, y se recubren con el ADN que se desea transferir a las plantas. Para que las micropartículas pueda atravesar las membranas celulares y llegar al núcleo de las células blanco, son impulsadas a gran velocidad por explosión de pólvora seca, liberación de gas comprimido a alta presión (aire, helio, CO2 o N₂), o por una descarga eléctrica de una gota de agua. Una vez dentro del tejido vegetal el ADN se desprende de las micropartículas debido a las modificaciones del entorno iónico.

Si las partículas atraviesan las membranas y son atrapadas en el núcleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinación al azar, lo que se considera como transformación estable.

Microinyección.

La microinyección es un proceso que consiste en utilizar microagujas para insertar sustancias a un nivel microscópico o en el límite de lo macroscópico dentro de una célula viva. Es un simple proceso mecánico en el cual una aguja extremadamente fina penetra la membrana celular y a veces la membrana nuclear para lanzar su contenido. La microinyección es normalmente realizada bajo un microscopio óptico llamado micromanipulador. El proceso es frecuentemente usado como un vector en ingeniería genética y transgenética para insertar material genético en una célula. El proceso de clonación también involucra microinyecciones.

Las microagujas miden alrededor de 10 micrómetros. Pueden contener cerca de 15 microlitros de ADN. Es similar a la sección transversal de un cabello humano. Es un método muy preciso de transferencia génica. Requiere personal capacitado.

Electroporación.

En biología molecular, el proceso de electroporación es usado habitualmente para la transformación de bacterias, levaduras y protoplastos vegetales. Además de membranas lipídicas, las bacterias también tienen una pared celular compuestas de peptidoglicano y sus derivados.

La electroporación o electropermeabilización es un significativo aumento de la conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular causado por un campo eléctrico aplicado externamente. Es habitual en biología molecular como forma de introducción de diferentes sustancias en células, como por ejemplo sondas moleculares, un fármaco que puede cambiar las funciones celulares o un fragmento de DNA codificante, como puede ser un plásmido.

Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmática excede su rigidez dieléctrica se forman poros. Si la fuerza del campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al mismo se eligen apropiadamente, los poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto período, durante el cual los compuestos extracelulares tienen la oportunidad de entrar a la célula. Sin embargo, una exposición excesiva de células vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis o necrosis, procesos que provocan la muerte celular.

9.2.2 Químicos.

Basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a las membranas (lipofección).

MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO.

Se empezó a usar esta técnica en los años 60, pero fue en los 70 cuando se empezó a desarrollar suficientemente para tener buenas eficacias de transfección. Se basa en la precipitación del DNA exógeno y los iones de calcio, provocando que la célula, mediante endocitosis, introduzca el DNA en su interior. La eficacia de transfección puede llegar al 10% de las células, aunque suele ser transitoria.

No es una técnica que provoque toxicidad en las células pero la expresión del transgen es muy pequeña. Únicamente se usa en cultivos celulares, y por lo tanto su aplicación es "ex vivo".

MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO.

Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE  dextrano se limita a las transfecciones transientes.

MÉTODO DE LIPOFECCIÓN.

Se basa en la formación de complejos entre lípidos catiónicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el citosol. Es esencial optimizar las condiciones específicas de Transfección para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la placa. Las desventajas del método son, aparte del elevado precio de los lípidos, el hecho de que no todos los lípidos funcionan en todos los tipos celulares, y que hay que optimizar el ensayo para cada tipo celular.

DNA DESNUDO

Consiste en la introducción del DNA en una solución salina o sérica, normalmente mediante inyección intramuscular, para conseguir la expresión del transgén. Se ha observado actualmente expresión en timo, piel, músculo cardíaco y músculo esquelético. No se conoce el mecanismo por el que llega a entrar a la célula aunque se postula que es a través del complejo del poro nuclear.

Tiene un bajo porcentaje de células transfectadas, no hay integración en el genoma y una vez inyectado no hay replicación en el genoma. Este es un sistema utilizado para la realización de la terapia génica "in vivo".

Péptidos fusiogénicos

Los  péptidos fusiogénicos surgen en una línea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada. Estos péptidos fusiogénicos se utilizan para compactar DNA.

Mecanismos de transferencia natural

9.1 Mecanismos de transferencia natural.

9.1.1 Transformación.

La transformación en genética se refiere a la alteración genética de una célula que resulta de la introducción y expresión de material genético externo (DNA). En bacterias, la transformación se refiere en el intercambio genético producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive.

9.1.2 Conjugación.

En este proceso, una bacteria donadora F+ transmite a través de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plásmido F, además del cromosoma bacteriano.

La duraciónón del contacto entre bacteria dadora y bacteria receptora condiciona la importancia del fragmento cromosómico transmitido. El estudio de la conjugaciónón ha permitido establecer los mapas cromosómicos de ciertas bacterias. Ciertamente, la conjugaciónón juega un papel en la aparición en las bacterias de resistencia a los antibióticos.

9.1.3._Transducción.

En 1951 Joshua Lederberg y su colaborador Zinder estaban investigando en Salmonella la posible existencia de un sistema de conjugación al estilo del que se acababa de descubrir en su pariente Escherichia coli. Mezclaron dos cepas de Salmonella, cada una con un juego distinto de marcadores genéticos. (Eureka! Obtuvieron recombinantes. Descartaron que se tratara de transformación, ya que los resultados eran similares si añadían DNAsa al sistema. Entonces, ¿era un fenómeno de conjugación? Realizaron el experimento del tubo en “U”, con una membrana separando los dos brazos de la U, en cada uno de los cuales se colocaba una de las cepas. La membrana impide el paso de bacterias y los contactos intercelulares directos entre las dos cepas. Pues bien... seguía habiendo recombinantes. Esto descartaba, pues, que se tratara de conjugación. Se postuló que debía de existir un “agente filtrable” resistente a las nucleasas, responsable último de la transferencia genética.

La transducción se puede definir como el proceso de transferencia genética desde una célula donadora a otra receptora mediatizado por partículas de bacteriófagos que contienen ADN genómico de la primera. En la transducción podemos distinguir dos etapas diferenciadas:

1.      Formación de la partícula fágica transductora: un trozo de material genético de la célula donadora se introduce en el interior de la cabeza de la cápside de un fago. Las partículas transductoras son en cierta manera “subproductos” anómalos del ciclo normal del fago.

2.      La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, donde este ADN puede eventualmente recombinarse y expresar su información.

Siguiendo con la buena racha de descubrimientos, pocos años más tarde (1956), el mismo Lederberg (esta vez junto con su mujer, y con Morse) hallaron un tipo nuevo de transducción, mientras estaban estudiando el sistema del fago moderado l y su hospedador, E. coli. Este tipo de transducción recibió el nombre de transducción especializada.

Se caracteriza porque en ella se puede transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano, con tal de que tenga un tamaño compatible con la capacidad de “empaquetado” de ADN de la cápside del fago. La partícula transductora (pseudovirión) se forma por empaquetamiento anómalo de ADN genofórico bacteriano. En el interior de la cabeza del pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago. Las partículas transductoras sólo se forman como consecuencia de infecciones líticas del fago.

Recordemos que fue descubierta por el equipo de Lederberg (1956), mientras hacían experimentos de inducción de células de E. coli lisogenizadas con el fagol. Este tipo de transducción consiste en la transferencia -mediatizada por fagos moderados producidos en la inducción de un cultivo lisogénico-, de un número limitado de marcadores, correspondientes a los loci genéticos adyacentes al sitio de integración del profago. La transducción restringida nunca ocurre por infecciones líticas. El ADN transducido va unido a ADN del fago.

La transducción especializada con el fago l permitió los primeros aislamientos (“clonaciones”) de genes in vivo, pero por supuesto, desde mediados de los años 70 la clonación de genes se realiza ya con métodos de ADN recombinante (ingeniería genética).

9.1.5 Transfección.

La Transfección es una técnica empleada para introducir fragmentos de ADN adicional en células de mamíferos. El vehículo que transporta el nuevo ADN es un virus capaz de infectar a la célula. La información genética del virus es modificada previamente, sustituyendo genes que codifican proteínas implicadas en la virulencia y en la replicación del virus por genes de interés que se desea insertar en el mamífero. En muchos casos se transfectan genes que codifican proteínas con función terapéutica o genes necesarios para restaurar una deficiencia génica.